-
Mikwoskòp konfokal refere a yon kalite mikwoskòp espesyal optik ki ka anrejistre tranch optik.
Pa eklere ak obsève yon pwen limit difraksyon sèl, se tranch optik reyalize nan yon sistèm konfokal lazè. Sa mande pou de segments yo gwo bout bwa gen menm konsantre a, se konsa yo "konfok". Kontrèman ak imaj lajè-jaden, imaj konfokal pa gen okenn defocusing flou. Sa a se yon avantaj nan tèt li, paske imaj la gwo twou san fon nan echantiyon an se klè ak moun rich nan detay. Sepandan, avantaj ki pi enpòtan an se potansyèl ki genyen twa dimansyon vizyalizasyon li yo ak karakteristik mikwoskopik. Apre se sekans nan imaj akeri ansanm Z-chemine a, se objè a 3D rekonstwi ak parèt pa òdinatè a.
- Konfok ekleraj
Se pwen ekleraj sous limyè reyalize pa konsantre sous la limyè sou yon Ouverture ti (pinhole) ak Lè sa a, konsantre li sou echantiyon an. Lè Ouverture a se ti ase, se pwen an ekleraj sèlman limite pa difraksyon, pa pa paramèt yo jewometrik nan sous limyè ak Ouverture. Sous limyè òdinè se yon gwo sous limyè sifas, kidonk li enposib pou konsantre li sou plas limit difraksyon an. Se poutèt sa, byenke transmisyon an se trè ba, sa a kalite limyè konsantre ekleraj se toujou trè nesesè (pou sous limyè tradisyonèl).
Figi 1: ekleraj pou konfokal D '. Limyè a soti nan sous la limyè (LS) konsantre sou pinhole nan ekleraj (PI) ak Lè sa a, antre nan echantiyon an ..
Lazè kòm yon sous limyè gen kolimasyon trè wo (limyè a nan yon lazè bon se "trè paralèl"). Se poutèt sa, lazè a ka konsantre sou yon plas difraksyon-limite nan yon lantiy sèl san yo pa itilize yon pinhole. Se poutèt sa, pi konfokal mikwoskòp pa gen okenn lumières pinhole. Bon jan kalite a nan plas la limyè depann sou bon jan kalite a gwo bout bwa nan lazè a. Si bon jan kalite a se pa bon, ou ka tou insert twou a ekleraj. Se lazè a anjeneral makonnen ak mikwoskòp la konfokal nan fib optik. Fib sa yo tèt yo tou aji kòm pinholes.
Fokalizasyon an ak dansite enèji segondè nan lazè fè li yon sous ideyal limyè pou mikwoskòp confocal. Koerans nan lazè se pa yon karakteristik obligatwa nan pèfòmans konfok. Okontrè, li se yon defi pou konsèpteur optik, paske li pral lakòz modèl fo entèferans, se konsa estrateji konsepsyon atansyon yo bezwen.
Anplis de sa, lefèt ke lazè a tradisyonèl sèlman emèt yon koulè sèl (lazè- "liy") gen limit pwòp li yo. Nan milti-fluoresans D 'ak mezi, konplèks aranjman milti-lazè ki nesesè. Lazè blan abilman rezoud pwoblèm lan nan milti-koulè D '.
Figi 2: Konparezon nan konfokal (zòn dwat) ak ki pa Peye-konfokal D '. Nan feulgen tache sourit trofoblast. Yon anpil enfòmasyon nan imaj ki pa konfokal pa soti nan avyon fokal. Konfok optik elimine tout faktè mou ak fè estrikti a klè.
Deteksyon konfokal
Pifò detektè gen yon zòn san patipri gwo sansib (tib photomultiplier yo anjeneral plizyè santimèt kare). Konfok optik bezwen pwen kèk. Se poutèt sa, li nesesè fè deteksyon plas pa mete yon ti Ouverture (pinhole) nan gwo bout bwa a limyè. Konsantre limyè a nan echantiyon an sou pinhole a, kolekte ak anrejistreman limyè a transmèt.
Paske modèl la difraksyon depann sou Ouverture la nimerik ak longèdonn, deteksyon pinhole ki nesesè. Se poutèt sa, lè paramèt sa yo chanje, gwosè a pinhole dwe ajiste.
Lè lantiy la objektif chanje (anjeneral ak chanjman nan Ouverture nimerik), modèn konfokal mikwoskòp optik pral otomatikman chanje dyamèt la pinhole kòmsadwa. Se poutèt sa, pinholes yo anjeneral ki fèt kòm doub oswa milti-kouch ouvèti.
An reyalite, gwosè ki apwopriye a nan pinhole depann pa sèlman sou longèdonn ak Ouverture nimerik, men tou sou mikwoskòp la entèn nan eleman optik nan mikwoskòp.
Se poutèt sa, li se pa sèlman endezirab, men tou sa ki mal dirèkteman konpare dyamèt pinhole nan mikwoskòp ak desen diferan. Si dyamèt la pinhole pa mete nan valè a pi bon, sistèm lan pa yo pral kapab fè optik tranche san pwoblèm (ki se, transmèt defocus flou), oswa koupe entansite a san nesesite san yo pa jwenn plis bon jan kalite optik tranche (sa ki lakòz imaj bri nesesè).
Figi 3: Deteksyon nan D 'konfokal. Se limyè a soti nan echantiyon an S konsantre sou pinhole a obsèvasyon (PO) ak Lè sa a, sou detektè a de.
Chemen optik nan optik konfokal
Path la konfokal gwo bout bwa nan konfokal sistèm optik se sèlman konbinezon an nan pwen ekleraj sous ak deteksyon pwen. Ka konbinezon sa a dwe itilize kòm yon kouto optik. Se sèlman foton ki soti nan plan fokal la ka transmèt nan Capteur a. Pandan ke tout foton soti nan lòt kote yo filtre soti. Optik tranche reyalize pa vle di nan "filtre espasyal".
Paske sèlman yon sèl plas parèt "konfok" D 'nan yon tan bay yo, se yon aparèy analysis ki nesesè pou avanse pou pi plas la sou jaden an objè nan yon mòd griy. Anjeneral, se glas la optik enstale sou motè a analysis ak itilize egzekite pwosedi a analysis. Gen yon konstriksyon nan tan ki nesesè yo analysis yon ankadreman plen (anjeneral) 1,024 liy yo. Amelyorasyon yo te reyalize pa entwodwi yon scanner gwo vitès (eskanè sonorite) ki analiz 8, 000 oswa plis liy pou chak dezyèm.
Se sèlman anba teknoloji a mikwoskòp nan limyè reflete ka yon bon tranch optik reyalize. Sa a se youn nan rezon ki pou devlopman wòdpòte nan mikroskopi fluoresans nan 20 dènye ane yo (lòt rezon ki gen ladan envansyon nan imunite, ADN-ibridasyon, fliyoresan biosensor, pwen pwopòsyonèl ak pwoteyin fliyoresan).
Figi 4: de goch a dwat: 1. Kòn nan ekleraj pa sèlman susit lank la fliyoresan nan plan an fokal, men tou, susit li leve, li desann. Isit la reprezante pa yon kòn vèt doub. 2. Pinhole emisyon an efektivman segman aks dèz limyè ki emèt soti nan pi wo a plan fokal la. Anplis de sa, limyè a soti nan anba a avyon an fokal pa pral pase nan pinhole la. 4. Nan sistèm konfokal la, se sèlman limyè ki soti nan echantiyon an pral rive nan detektè a. Detekte pinholes pral efektivman rejte nenpòt ki limyè soti nan lòt zòn. Finalman, se seksyon an reyèl optik jwenn.
